PCR實驗室的污染來源

　　1、樣本間交叉污染：

　　收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴外溢;不同樣本移液時忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖;移液器等實驗器具及耗材未及時消毒滅菌;不同樣本同時開蓋或樣本劇烈震蕩、反復吹吸導致氣溶膠形成擴散，相互交叉污染。

　　2、實驗試劑污染：

　　主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中，由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。 加樣過程中，因為 PCR 試劑對溫度十分敏感，需要通過冰浴使得 PCR 試劑和 PCR 板/管處于 0℃，但這個過程也是充滿了污染的風險的。

　　3、擴增產物污染：

　　大量拷貝的產物泄漏或擴增后的PCR反應管意外開蓋，這是 PCR 反應中最主要最常見的污染問題。因為 PCR 產物拷貝量大，遠遠高于 PCR 檢測數個拷貝的極限，所以極微量的 PCR 產物污染，就可形成假陽性。

　　4、克隆質粒污染：

　　作為陽性質控品的克隆質粒外溢。

　　PCR實驗室的防污染方法

　　按照實驗室的安全工作制度或安全標準操作程序，所有操作符合《實驗室生物安全通用要求》(GB19489-2008)。

　　1、嚴格執行各區功能劃分：

　　試劑儲存和準備區：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應混合液的準備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。

　　標本制備區：核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管。對于涉及臨床樣本的操作，應符合生物安全二級實驗室防護設備、個人防護和操作規范的要求。

　　擴增區：cDNA合成、DNA擴增及檢測。

　　擴增產物分析區：擴增片段的進一步分析測定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。

　　試劑準備區、樣本制備區和擴增區內的實驗用品，包括移液器等器具應專用，空氣、物品流向依次為：試劑準備區、樣本制備區、擴增區、產物分析區，不可逆行。

　　2、清潔的實驗用品：

　　實驗室自配試劑(去離子水、緩沖液等)和所有使用器具在使用之前均應高壓滅菌或紫外殺菌。槍尖、反應管等實驗耗材應一次性使用。

　　3、正確的實驗操作：

　　實驗應在超凈工作臺內進行，工作臺內應放置PCR專用的微量離心機、各量程的移液器和其他必需物品。

　　實驗的過程中選擇最合適尺寸的手套并能及時更換，在進出不同實驗區域或進行模板操作后都應更換實驗服、口罩、帽子及手套，以避免不同實驗區交叉污染。

　　裝有PCR試劑的反應管在打開之前應先瞬時離心，將管壁及管蓋上的液體離至管底，降低污染手套或加樣器的風險;謹慎開啟反應管，防止管內液體濺出或形成氣溶膠導致污染。

　　吸加試劑和模板的操作應嚴格按照規范要求進行，遵守“慢吸快打”原則，盡量一次性完成，忌多次抽吸，以避免氣溶膠產生的交叉污染。

　　PCR試劑建議小量分裝，以減少反復凍融、重復取樣次數;多樣本PCR反應時，先配制反應混合液分裝至反應管中，最后加入樣本核酸，請勿同時開蓋，盡量保證單人單管，實現完全閉管操作。

　　實驗試劑應與樣品和PCR產物分開保存，不應放于同處。

　　PCR擴增實驗完成后及時將反應管取出，用一次性手套將產物反應管包裹丟棄，保證管蓋緊閉。

　　4、規范的實驗設計：

　　應遵循實驗室內部質量控制的相關規定，實驗中設立陽性對照、陰性對照和空白對照，全程質控實驗過程，驗證PCR反應的可靠性，并協助判斷擴增系統的可信性。

　　PCR實驗室的污染應急處理方法

　　1、若核酸樣本溢出：

　　立即用布或紙巾覆蓋，由外圍向中心傾倒10%的次氯酸消毒劑，約30分鐘后，清除污染物品，再用次氯酸消毒劑擦拭，并用75%酒精噴灑，移動紫外車定點照射1小時。

　　2、其他不明情況污染：

　　(1)暫停所有實驗操作;

　　(2)清理實驗室內所有物品，尋找污染來源;

　　(3)加大實驗室的通風;

　　(4)對實驗室內所有表面(臺面、地面及墻面) 進行消毒;

　　(5)75%酒精空中噴霧;

　　(6)開啟紫外消毒裝置，延長紫外照射時間(4小時以上);

　　(7)以上措施每日進行，直至污染消除;用新試劑及確認無污染的器材進行原污染項目的試劑空白檢測，連續3次均陰性后方可進行常規檢測。