基因測序領域在備受青睞的同時，也面臨著獲得上市審批的巨大挑戰。截至到目前，除了一些一類通用試劑和測序設備外，僅有應用于產前篩查的基因二代測序試劑已獲得國家食品藥品監督管理總局的批準，至于應用于其他領域的二代測序試劑，有些商家正為此積極準備，包括產品的注冊檢測和臨床試驗等。

 

　　由于此項技術在世界范圍內還沒有被廣泛地應用于臨床診斷，因此，在注冊準備過程中，缺乏必要的信息作為參考。

 

　　FDA發布傳染病二代測序診斷器械注冊審查指南草案

 

　　2016年5月13日，美國FDA在其官網上發布《基于二代基因測序的傳染病診斷器械：微生物鑒定及耐藥性和毒力標志物的檢測》,并對外公開征求意見，反饋時間截至2016年8月11日。

 

　　該指南適用于使用靶向測序或宏基因組測序檢測傳染病病原或耐藥性及毒力標志物是否存在的二代基因測序器械，不適用于旨在篩選血液、細胞或組織的供體的器械。本文提煉了該指南草案中針對分析性能評估部分的要求，供大家探討。

 

　　1. 最低檢測限

 

　　該指南草案指出，針對靶向測序和宏基因組測序兩種情況下最低檢出限的確定方法是完全不同的。對于宏基因組測序，需要視具體情況來確定評估方法。對于靶向測序，最低檢測限的確立通常是采用95%(n≥20)的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標準，具體試驗設計可參見 “Highly Multiplexed Microbiological/Medical Countermeasure In VitroNucleic Acid Based Diagnostic Devices” (http://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/UCM327294.pdf)。

 

　　此外，也可以根據產品設計合理的評估方案，采用概率分析法來建立最低檢測限。具體試驗設計可參見“EP17-A2, Evaluation of Detection Capability for Clinical LaboratoryMeasurement Procedures; Approved Guideline; 2012”。

 

　　2. 靈敏度與特異性

 

　　靈敏度與特異性能夠反映出對不同來源的樣本，其特異性檢出預期用途中聲稱的所有序列的能力。通常評價所用的樣本來源于預分析的臨床培養樣本，其濃度應位于最低檢測限附近。如臨床培養樣本難以獲得或者管制微生物，可以考慮使用預抽提DNA或者構建序列作為分析樣本。

 

　　3. 干擾物質

 

　　建議根據試劑盒所采用的樣本類型，確定潛在的干擾物質。干擾物質可能來自內源物質(如溶血、黃疸及脂血樣本等)或外源物質(如處方藥及非處方藥、抗凝劑等)。具體試驗設計可參見CLSI “EP07-A2, Interference Testing in Clinical Chemistry; ApprovedGuideline; 2005”。該指南同時列出了基于靶向測序和宏基因組測序的產品根據其預期用途應提交的干擾試驗清單。

 

　　4. 精密度(可再現性和重復性)

 

　　應進行可再現性評估，來對可能影響檢測重復性的多個變量進行驗證。如選擇不同的實驗室，由不同的操作人員使用不同批號的試劑，在一段時間內對同一測試樣品測量結果的精密度評估。具體試驗設計可參考CLSI “EP12-A2, User Protocol for Evaluationof Qualitative Test Performance; Approved Guideline; 2008”。

 

　　同樣地，對產品應進行重復性評估，以評價在一定的檢測條件下，對標準物質進行多次重復檢測后的測量精密度。具體試驗設計可參考CLSI ” EP12-A2, User Protocol for Evaluation of Qualitative TestPerformance; Approved Guideline; 2008 “。

 

　　5. 檢測系統的攜帶污染和交叉污染

 

　　應評估攜帶污染對檢測結果可能帶來的影響，包括對整個測試系統的評估，如核酸的分離純化、文庫制備、陽性樣本(待測靶核酸呈強陽性的濃度)和陰性樣本的交替檢測。產品的標簽上應標示攜帶污染率相關信息以提示用戶。而且，基于攜帶污染率的高低，有些可能還需要在產品的包裝標簽上給出其他額外的信息，比如警告、注意事項和清洗說明，以指導用戶如何降低或消除對試驗結果帶來的影響。

 

　　6. 穩定性

 

　　應進行產品的效期穩定性試驗并提供研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。如適用，應提供加速穩定性試驗方案和研究結果。應對每項研究給出合理的評價指標以及確定依據。

 

　　7. 其它性能試驗

 

　　依據產品的預期用途、樣本類型和試驗設計，建議進行以下研究：

 

　　1)基質等同性研究(如適用);

 

　　2)新鮮樣本和冷凍樣本的比較研究;

 

　　3)樣本穩定性研究;

 

　　4)交叉感染研究。